Набор ПОЛИГЕП-С БИОТИТР

Набор ПОЛИГЕП-С БИОТИТР – набор для качественного и количественного выявления РНК вируса гепатита С (ВГС, HCV) в сыворотке/плазме крови методом полимеразной цепной реакции.

НАБОР СОСТОИТ ИЗ ДВУХ КОМПЛЕКТОВ:

• "РНК–ЭКСПРЕСС" - комплект для выделения РНК вируса гепатита С из сыворотки или плазмы крови;
• "Набор для проведения ОТ-ПЦР" - комплект для проведения анализа методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

"РНК–ЭКСПРЕСС" "Набор для проведения ОТ-ПЦР"

ОСНОВНЫЕ ПРЕИМУЩЕСТВА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ПОЛИГЕП-С БИОТИТР:

• Одностадийная процедура выделения РНК не требует выполнения сложных манипуляций;
• Сокращение продолжительности пробоподготовки позволяет обработать большее количество биопроб за рабочую смену;
• Отсутствие высокотоксичных реагентов (фенола, хлороформа, меркаптоэтанола, изопропилового спирта) обеспечивает полную безопасность процедуры пробоподготовки для персонала;
• Существенное снижение расхода лабораторного пластика;
• Перед постановкой ОТ-ПЦР выделенная РНК не нуждается в обработке ДНК-азами, так как в процессе выделения РНК не выделяется вирусная и человеческая ДНК;
• РНК полностью готова для последующей постановки ОТ-ПЦР;
• Низкая себестоимость процедуры пробоподготовки позволяет снижать себестоимость диагностического теста;
• Одновременное проведение реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции позволяет существенно сократить общее время исследования
• Общее время анализа, включая процедуру пробоподготовки, не превышает 2 ч 20 мин;
• Надежность количественного определения вирусной нагрузки по 4-м стандартным калибровочным пробам;
• Специфичность праймеров к наиболее консервативным участкам генома ВГС позволяет одновременно выявлять РНК ВГС разных генотипов;
• Выделение РНК без ДНК в ходе пробоподготовки и высокая надежность специфичности исследования позволяет выявлять только вирус гепатита С и полностью исключает перекрестные реакции с другими микроорганизмами;
• Флуоресцентная детекция результатов реакции ОТ-ПЦР в ходе определения РНК ВГС обеспечивает максимальную защиту от контаминации клиничесих проб и лабораторного помещения продуктами реакции амплификации и, следовательно, от ложноположительных результатов.

ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ПОЛИГЕП-С БИОТИТР:

• Метод выделения РНК ВГС – перейти к описанию комплекта "РНК ЭКСПРЕСС";
• Метод определения РНК ВГС. РНК ВГС в сыворотке/плазме крови определяется методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (FRT);
• Принцип ОТ-ПЦР. Реакция обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (OT-ПЦР) является вариантом ПЦР, позволяющая получать многочисленные копии ДНК, комплементарной искомому фрагменту РНК. Первой стадией OT-ПЦР является реакция обратной транскрипции: синтез на матрице РНК комплементарной ДНК (кДНК) с помощью фермента обратной транскриптазы. В дальнейшем в результате классической полимеразной цепной реакции в ходе многократной амплификации происходит накопление искомого фрагмента кДНК;
• Принцип FRT. Принцип действия наборов реагентов основан на использовании метода ПЦР для определения специфических участков РНК возбудителей путем накопления (амплификации) специфических фрагментов;
• Характеристика флуоресцентных зондов. Зонд для специфического фрагмента содержит флуорофор FAM ( поглощения – 494; испускания – 520); зонд для внутреннего контроля содержит флюорофор HEX ( поглощения – 535; испускания – 553). Особая структура зонда класса Pefect Probe позволяет достигать максимального разрешения метода флуоресцентной детекции за счет максимальной разницы между фоновым и специфическим сигналом;
• Чувствительность определения РНК ВГС. С помощью набора ПОЛИГЕП-С БИОТИТР можно обнаружить 103/мл и более копий РНК вируса гепатита С в сыворотке или плИзме крови, что соответствует 370 МЕ/мл в соответствии со Вторым международным стандартом ВОЗ (WHO) для тестов, выявляющих РНК ВГС (NIBSC 96/798);
• Специфичность. Специфичность определяется олигонуклеотидными затравками (праймерами), подобранными к наиболее консервативным участкам генома (5’ нетранслируемая область) среди всех известных генотипов ВГС, а также специфичными флуоресцентными олигонуклеотидными зондами, комплементарно гибридизирующимися только со специфическими продуктами амплификации – точными копиями искомого фрагмента консервативного участка РНК ВГС;
• Характеристики количественного определения РНК ВГС. Зависимость концентрации РНК ВГС в образцах сыворотки/плазмы крови при разведении их сывороткой/плазмой крови, не содержащей РНК ВГС, имеет линейный характер в диапазоне концентраций 103 - 106 копий РНК ВГС на мл и составляет ±10%. Надежность количественного определения вирусной нагрузки обеспечивается параллельным определением титра вируса в 4-х стандартных калибровочных пробах.
• Калибровочные пробы представляют собой защищенную неинфекционную РНК в растворе TE-буфера, несущую фрагменты последовательности вируса гепатита С и содержат известные количества РНК (103, 104, 105 и 106 копий РНК ВГС/мл).

КОМПЛЕКТ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ РНК "РНК ЭКСПРЕСС"

Комплект представляет собой реагент в пробирках для выделения РНК из биопроб с целью последующего анализа методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

Подготовка клинического материала к постановке реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с целью выявления РНК-содержащих вирусов в диагностических целях проводится с применением метода термо-коагуляционного кондиционирования РНК.

ПРЕИМУЩЕСТВА "РНК-ЭКСПРЕСС" В СРАВНЕНИИ С ДРУГИМИ НАБОРАМИ

Критерий сравнения «РНК-ЭКСПРЕСС» Метод фенол-хлороформной экстракции Состав набора Готовый раствор, расфасованный в пробирки

• Денатурирующий раствор
• Изопропиловый спирт
• Раствор носителя (т-РНК)
• Промывочный раствор
• Деионизированная вода
• Хлороформ

Принцип выделения Термо-коагуляционного кондиционирования РНК Двухфазное разделение Полнота выделения РНК из образца Близкая к 100%.
РНК полностью остается в растворе, так как нет разделения и переноса фаз Нестабильный процент выхода РНК вплоть до ложноотрицательных результатов при случайном засасывании микроосадка РНК со дна пробирки в процессе промывки Влияние посторонних примесей в пробе В процессе выделения РНК не происходит выделения ДНК. Не требуется добавлять ДНК-азы Одновременно с РНК выделяется ДНК. Добавление ДНК-аз обязательно Защита от перекрестной контаминации от «пробы к пробе» и возможной контаминации продуктами ПЦР Практически полная защита, так как пробирка после внесения биологического материала ни разу не открывается, не требуется добавлять дополнительные реагенты Высокий риск контаминации поверхностей и проб во время аэрозольного разбрызгивания в процессе большого количества манипуляций Защита персонала лаборатории При сохранении целостности пробирки гарантируется практически полная защита персонала лаборатории от инфекционного агента Персонал лаборатории подвергается риску заражения инфекционным агентом и вредному воздействию гепатотропных токсичных реактивов Стадии выделения РНК 1 стадия – прогревание при 90°С 15 стадий Стадии общей процедуры пробоподготовки 3 стадии:

• перемешивание (вортексирование)
• погревание
• центрифугирование

20-25 стадий (в зависимости от модификации метода) Время на обработку 100 проб 30 мин 2-2,5 часа Расход лабораторного пластика Существенно снижается расход лабораторного пластика Требуются дополнительные пробирки и наконечники из-за необходимости переноса разделенных фаз Необходимость наличия вытяжного шкафа Не требуется Обязательно наличие вытяжного шкафа из-за высокой токсичности фенола и хлороформа

КОМПЛЕКТ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ОТ-ПЦР

КОМПЛЕКТ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ОТ-ПЦР - набор для качественного и количественного выявления РНК вируса гепатита С (ВГС, HCV) всех генотипов в сыворотке/плазме крови с диагностическими целями при лабораторной диагностике вирусного гепатита С методом полимеразной цепной реакции.

КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ДЕТЕКЦИИ РНК ВГС С ПОМОЩЬЮ КОМПЛЕКТА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ОТ-ПЦР

• Диагностическое подтверждающее исследование положительного результата серологического тестирования на антитела к ВГС (anti-HCV)
• Диагностическое подтверждающее исследование у серонегативных лиц
• Ранняя диагностика вирусного гепатита С
• Определение показаний к назначению противовирусной терапии
• Контроль эффективности противовирусной терапии
• Контроль перинатальной передачи вируса гепатита С

СОСТАВ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ПОЛИГЕП-С БИОТИТР:

А. Комплект для выделения РНК ВГС « РНК-ЭКСПРЕСС»

Состав Комплектация

Реагент РНК-ЭКСПРЕСС

110 пробирок (по 200 мкл)

Положительный контрольный образец 5 пробирок (по 300 мкл) Отрицательный контрольный образец 5 пробирок (по 300 мкл)

Б. Набор реагентов для постановки реакции ОТ-ПЦР FRT

Формат
Маркировка Состав Комплектация Формат
качественный 1. Реакционная смесь 1 пробирка (1500 мкл) 2. Taq-полимераза 1 пробирка (100 мкл) 3. Обратная транскриптаза 1 пробирка (30 мкл) 4. Разбавитель 1 пробирка (по 2 мл) 5. Дитиотрейтол (DTT) 1 пробирка (30 мкл) 6. Ингибитор рибонуклеаз 1 пробирка (70 мкл) 7. Положительный контроль ПЦР 2 пробирки (по 45 мкл) Формат
количественный 1. Реакционная смесь 1 пробирка (1500 мкл) 2. Taq-полимераза 1 пробирка (100 мкл) 3. Обратная транскриптаза 1 пробирка (30 мкл) 4. Разбавитель 1 пробирка (по 2 мкл) 5. Дитиотрейтол (DTT) 1 пробирка (30 мкл) 6. Ингибитор рибонуклеаз 1 пробирка (70 мкл) 7. Калибровочная проба 103 копий РНК/мл 2 пробирки (по 45 мкл) 8. Калибровочная проба 104 копий РНК/мл 9. Калибровочная проба 105 копий РНК/мл 10.Калибровочная проба 106 копий РНК/мл